1575 ernennt Kaiser Maximilian II. (1527–1576) Hugo Blotius (1533–1608), einen weit gereisten holländischen Gelehrten, zum ersten offiziellen Bibliothekar der kaiserlichen Hofbibliothek. Als er sein Amt übernimmt, ist die Bibliothek in einem Raum des Minoritenklosters in der Nähe der Hofburg untergebracht. Seine wichtigste Aufgabe liegt in der Inventarisierung der Bestände und so legt Blotius einen Index der Bestände nach Autoren an. U. a. verfasst er auch einen thematischen Turcica-Katalog, der helfen sollte, sich über den damals gefährlichsten Feind des Reiches zu informieren. Bei Amtsantritt von Blotius umfasst die Bibliothek etwa 7400 Bände Handschriften und Drucke mit über 20.000 darin enthaltenen Werken (Adligaten); zu Ende seiner Amtszeit (1608) wird der Bestand auf über 11.000 Bände geschätzt.
1623 übersiedelt die kaiserliche Bibliothek vom Minoritenkloster ins "Harrachsche Haus", einem Gebäude das zur kaiserlichen Burg gehörte (heute Ballhausplatz) und in dem die Kammerbuchhalterei untergebracht war. In diesen wesentlich besser geeigneten Räumen verbleibt die Bibliothek über 100 Jahre bis zu ihrer Übersiedlung in das neu gebaute Bibliothekgebäude am Josefsplatz.
Die politische Funktion der Hofbibliothek wird in der Folgezeit durch kaiserliche Verfügungen zur Ablieferung von Pflichtexemplaren unterstrichen. So bestimmt das kaiserliche Patent Ferdinands II. vom 26. August 1624 die Ablieferung je eines Exemplars jedes gedruckten Buches, das auf den Frankfurter Frühjahrs- und Herbstmessen angeboten wird. Dennoch erhält die Bibliothek die bedeutendsten Zuwächse noch immer durch den Ankauf bzw. die Verlagerung von größeren Bibliotheken.
Aufgrund einer gesetzlich vorgeschriebenen Betriebsversammlung öffnen alle Benützungseinrichtungen der Österreichischen Nationalbibliothek (Lesesäle am Heldenplatz und Sammlungen) am Donnerstag, 21. November 2024, erst um 11.30 Uhr.
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